Pendarfluor ialah kesan fizikal yang disebabkan oleh pancaran tenaga cahaya apabila sesuatu bahan diterangi oleh cahaya atau bentuk sinaran elektromagnet lain. Mikroskopi pendarfluor ialah mikroskop optik yang menggunakan pendarfluor dan pendarfluor in situ atau digabungkan dengan pantulan dan penyerapan untuk mengkaji sifat optik objek organik dan bukan organik. Mikroskopi pendarfluor membantu melihat struktur subselular dan dalaman objek dengan lebih jelas. Ia ditemui pada awal abad ke-20 oleh August Köhler, Carl Reichert dan Heinrich Lehmann.
Indeks artikel (klik untuk melompat)
Bagaimanamikroskop pendarfluorberfungsi
Mikroskopi pendarfluor berfungsi
Komponen mikroskop pendarfluor
1. Fluorofor
2. Sumber cahaya
3. Penapis pengujaan
4. Cermin dichroic
5. Penapis pelepasan
Kelebihan Mikroskopi Pendarfluor
Kelemahan mikroskop pendarfluor
Kegunaan mikroskop pendarfluor
Bagaimana mikroskop pendarfluor berfungsi
Mikroskopi pendarfluor biasanya berfungsi dengan mengotorkan komposisi dan struktur sampel dengan pewarna. Ini kerana kebanyakan komponen selular tidak berwarna. Oleh itu, mereka tidak boleh dibezakan dengan mudah antara satu sama lain. Fluorofor atau molekul pendarfluor yang diterangi dengan cahaya panjang gelombang pendek atau sinar elektromagnet cenderung untuk mengeluarkan cahaya. Cahaya yang dipancarkan mempunyai panjang gelombang yang lebih panjang berbanding dengan cahaya kejadian. Biasanya, tempoh antara penyinaran dan pelepasan diukur dalam nanosaat dan boleh diabaikan dengan mudah. Cahaya yang dipancarkan dipisahkan daripada cahaya kejadian, yang memberitahu lokasi tepat fluorofor. Imej sampel dijana berdasarkan cahaya sekunder dan bukan cahaya kejadian primer.
Mikroskopi pendarfluor berfungsi
Mikroskopi pendarfluor berfungsi sama seperti mikroskop cahaya. Ia terdiri daripada sumber cahaya yang kuat, penapis laluan jalur khas dan label pendarfluor sampel. Sampel yang akan dikaji diletakkan di bawah mikroskop. Cahaya dengan panjang gelombang cukup pendek untuk merangsang fluorophore diterangi pada sampel. Dengan bantuan kanta objektif, cahaya ini difokuskan pada sampel. Sinar pengujaan yang dipancarkan oleh sampel kemudian difokuskan pada pengesan melalui kanta objektif. Bahagian utama cahaya pengujaan dihantar melalui objek sampel, manakala sebahagian daripadanya dipantulkan kembali dan mencapai pengesan.
Komponen mikroskop pendarfluor
1. Fluorofor
Fluorofor ialah sebatian yang memancarkan cahaya apabila teruja oleh gelombang elektromagnet atau cahaya. Ia juga dipanggil pewarna pendarfluor. Fluorofor pada asasnya terdiri daripada gabungan kumpulan aromatik atau molekul planar/siklik dengan pelbagai ikatan π.
2. Sumber cahaya
Sumber cahaya adalah salah satu komponen terpenting dalam mikroskop pendarfluor. Di sini, sumber cahaya yang paling biasa digunakan untuk pengujaan termasuk laser, LED berkuasa tinggi, lampu arka xenon, lampu wap merkuri, dsb.
3. Penapis pengujaan
Penapis pengujaan yang digunakan dalam mikroskop pendarfluor biasanya penapis laluan jalur, yang membenarkan isyarat yang jatuh dalam lebar jalur tertentu sambil menolak semua isyarat lain. Panjang gelombang yang diserap oleh fluorophore melepasi dengan mudah, manakala sinaran optik yang dipantulkan disekat.
4. Cermin dichroic
Cermin dichroic bertindak sebagai penapis filem nipis. Tujuan utama cermin dichroic adalah untuk menghantar cahaya secara selektif daripada julat warna yang kecil sambil memantulkan semua warna lain. Ia juga dikenali sebagai penapis warna tepat.
5. Penapis pelepasan
Penapis pelepasan ialah penapis laluan jalur. Penapis pelepasan berfungsi sama seperti penapis pengujaan. Ia memancarkan cahaya yang dipancarkan oleh fluorofor sambil menghalang cahaya pengujaan.
Kelebihan Mikroskopi Pendarfluor
1. Kepekaan mikroskop pendarfluor adalah sangat tinggi, bersamaan dengan kira-kira 50 molekul per mikrometer padu.
2. Dengan mikroskop pendarfluor, molekul yang berbeza boleh dicelup dengan warna yang berbeza, membolehkan pengguna untuk imej berbilang molekul bahan pada masa yang sama.
3. Mikroskop pendarfluor lebih cekap daripada mikroskop optik tradisional.
4. Boleh digunakan untuk pengimejan in vivo dan in vitro.
5. Mikroskopi pendarfluor boleh memisahkan protein individu dengan ketepatan tinggi.
6. Mikroskopi pendarfluor paling sesuai untuk pengimejan dan mengkaji tingkah laku dinamik yang ditunjukkan oleh sel hidup.
7. Mikroskopi pendarfluor mampu menghasilkan imej beresolusi tinggi dan jelas, seterusnya meningkatkan penyelidikan.
8. Ia menggabungkan sifat pembesaran mikroskop optik dengan visualisasi pendarfluor.
9. Mikroskopi pendarfluor boleh digunakan untuk menghasilkan imej pembesaran 3D bagi sampel yang sedang dikaji.
Kelemahan mikroskop pendarfluor
1. Sebatian pendarfluor atau fluorofor yang terdapat dalam mikroskop pendarfluor cenderung kehilangan keupayaannya untuk memancarkan cahaya dari semasa ke semasa apabila teruja disebabkan oleh proses yang dipanggil photobleaching. Photobleaching biasanya berlaku apabila molekul fluorophore rosak secara kimia akibat pengujaan elektronik semasa pendarfluor.
2. Ia hanya membenarkan pemerhatian dan kajian struktur tertentu dalam sampel yang telah diserlahkan dan dilabelkan sebagai pendarfluor.
3. Apabila bahan pendarfluor disinari oleh cahaya, molekul pendarfluor sering menghasilkan bahan kimia, yang seterusnya membawa kepada fototoksisiti. Kesan fototoksik ini memusnahkan sifat asal sampel yang diperhatikan. Fototoksisiti sinaran cahaya gelombang pendek adalah agak tinggi.
4. Mikroskopi pendarfluor tidak dapat memberikan maklumat tentang dwilapisan lipid, terutamanya untuk SUV.
5. Mikroskopi pendarfluor tidak boleh menghasilkan sebarang pemerhatian konklusif yang berkaitan dengan watak dwilapisan atau lamelariti vesikel.
6. Penambahan probe dan pewarna sering mengganggu sifat vesikel lipid, yang membawa kepada tafsiran data yang tidak tepat dan dengan itu memusnahkan keaslian eksperimen.
7. Pengoksidaan lipid akibat cahaya boleh menyebabkan pembentukan domain.
Kegunaan mikroskop pendarfluor
1. Mikroskopi pendarfluor digunakan secara meluas untuk mengkaji struktur dalaman sampel pada tahap mikroskopik dengan kualiti tertinggi.
2. Mikroskopi pendarfluor paling sesuai untuk mengkaji sampel biologi hidup.
3. Mikroskop jenis ini sering diutamakan apabila melabel struktur terdalam sel atau mikroorganisma.
4. Membantu mengukur keadaan fisiologi sel atau sampel yang diperhatikan.
